Иммунологические механизмы проспидина in vitro при полиартрите хроническом неспецифическом (инфектартрит)

Полиартрит хронический неспецифический (RA) связан со многими иммунологическими отклонениями, служащими основанием для назначения иммунодепрессивных препаратов. Хотя некоторые из них больные полиартритом могут использовать на протяжении десятилетий, в целом их применение ограничено, особенно при лечении высокоактивных и рефрактерных инфектартритов с гормональной зависимостью. Поэтому постоянно продолжается поиск новых медикаментов.

Проспидин – новое иммунодепрессивное лекарственное средство (производное диспиротрипиперазина) – был выбран для больных, страдающих инфектартритом, в виду высокого и рано проявляющегося противовоспалительного эффекта, а также широкого диапазона соотношения терапевтических и токсических свойств, по сравнению с другими иммунодепрессантами. В отличие от других цитостатических средств проспидин обладает низкой проницаемостью мембраны и слабым воздействием на миотическую активность. Кроме инфектартрита проспидин широко применяется при лечении таких заболеваний, как саркома Капоши, туморы, хориоретинит. Это лекарство является альтернативой метотрексата (MTX) в терапии ифектартрита и отличается благоприятным соотношением цены и качества.

Несмотря на количество кратковременных (6-12 месяцев) клинических наблюдений, в которых было установлено, что проспидин является не мене эффективным, чем MTX и циклофосфамид, сведений о механизмах действия проспидина пока не достаточно. Классификация данного препарата в фармакологической номенклатуре пока тоже четко не определена. До настоящего времени проспидин рассматривали как агент алкилата, между тем его принцип действия скорее соответствует мембраностабилизирующим агентам. Клинические эффекты этого медикамента выражены в противовоспалительной и иммунодепрессивной активности. Хотя в России уже предпринимался ряд попыток, выяснить механизмы действия проспидина, количество полученных данных ограничено, главным образом из-за отсутствия современного оборудования и реагентов, позволяющих провести анализ лежащих в основе механизмов (особенно на уровне однородных клеток).

Основная цель данной работы заключается в выяснении иммунологических механизмов действия проспидина, и установление возможных причин срабатывания противовоспалительного эффекта препарата на более ранних стадиях.

Для обработки данного вопроса (с самого начала моего обучения на базе стипендии в октябре 1998г) я провел изучение следующих иммунологических методов:

1.Методы изоляции периферийных лимфоцитов крови (PBMC) и одноядерных клеток синовиальной жидкости и обеднения, очистки и обогащения различных субпопуляций лимфоцитов: T-, B-лимфоцитов, естественных киллерных клеток (NK-клеток), моноцитов и макрофагов (включая MACS =метод иммунномагнитной сортировки клеток).

2. FACS – анализы поверхности антигенов лейкоцитов на базе проточной цитометрии.

3. Различные методы функционального тестирования субпопуляции лейкоцитов, синтеза иммуноглобулина и производства цитокинов (иммуноферментный анализ ELISA, клеточный иммуноферментный анализ ELI-Spot), клеточной пролиферации.

4. Методы, предназначенные для поколения дендридных клеток.

5. Методы индуицрования и измерения уровня апоптоза в различных субпопуляциях лимфоцитов (метод проточной цитофлуорометрии).

6. Методы, оценки фармакологических свойств проспидина in vitro и клеточной жизнеспособности (определение токсических, субтоксических доз).

На данный момент исследованы следующие постановки вопроса:

l. Определение фармакокинетики препарата in vitro

Периферийные лимфоциты крови (PBMC) и субпопуляции (T-, B-лимфоциты) инкубировались с добавлением проспидина в концентрации от 500 μг/мл до 1 μ г/мл на протяжении 72 часов. Токсичность измерялась в анализах, полученных методом проточной цитометрии путем окраски красителем попидиумом - йодидом с интервалами в 24 часа. Рис. L отображает результаты для концентраций проспидина в диапазоне 25, 50, 75 μг/мл. Концентрация 50 μг/мл не рассматривалась как токсическая.

Рис. l: Токсичность проспидина.

Дальнейшие исследования показали, что проспидин оказывает более сильное токсическое воздействие на B-лимфоциты, чем на T-лимфоциты и NK-клетки.

2. Влияние проспидина на созревание дендровидных клеток

Дендровидные клетки (DC), были инкубированы из клеток CD14+ периферийной крови с добавлением IL-4, GM-CSF и TNF-αпри наличии нетоксической концентрации проспидина 50 μ г/мл на протяжении 10 дней. Затем фенотип DC (экспрессия типичных маркеров в поверхности DC, например, CD-la, CD40, CD54, CD58, CD80, CD83, CD86, HLA-DR) испытали методом проточной цитометрии. Никаких значительных изменений в экспрессии вышеуказанных антигенов (на поверхности) по сравнению с контролем (DC, дифференцированные в присутствии проспидина) не обнаружено.

3. Влияние проспидина на представление антигенов главного комплекса гистосовместимости класса II (MHC)

Клеточный иммуноферментный анализ интерферона - гамма (INF- γ) методом ELI-Spot выполнялся с DC, участвовавшими в фенотипических экспериментах (см. п. 2). Для этого дифференцировались дендровидные клетки с (DC(P)) и без (DC) проспидина. Эти DC обрабатывались в тесте ELI-Spot обезвреженным токсином столбняка и инкубировались с CD4+ лимфоцитами периферической крови при наличии или отсутствии проспидина (таблица l). Измеренные в тесте ELI-Spot INF- γ -  специфичные точки (spot) клеток CD4+ являются критерием способности пептидов столбняка к представлению с помощью главного комплекса гистосовместимости класса II антигена DC. В 4 отдельных экспериментах было установлено, что способность обрабатываемых поспидином DC представлять антигены по сравнению с необработанными клетками сократилась (между 28% к 32%). При этом каких-то существенных отличий между анализами методом ELI-Spot, проводимых с поспидином или при его отсутствии не отмечено (4-8%).

Таблица l: INF-y специфические точки под влиянием проспидина (50 μг/мл).

Чтобы более четко определить место действия проспидина в представлении антигена, были проведены дальнейшие эксперименты:

3.1. Анализ возможных эффектов проспидина на способность DC поглощать антигены

Для исследования влияния проспидина на поглотительную способность DC (рис. 2 - C) тест ELI-Spot был применен к уже дифференцированным DC, к которым проспидин не добавлялся во время фазы созревания. Эти дендровидные клетки обрабатывались токсином столбняка в отсутствии или присутствии проспидина. При проведении данных экспериментов также не были отмечены существенные различия между производством IFN-γ клеток CD4+ . Таким образом, проспидин не оказывает никакого влияния на поглощение DC антигенов.

3.2. Возможное действие проспидина на взаимодействие DC и T-лимфоцитов

Для исследования взаимодействия между лимфоцитами CD4+ и уже дифференцированными, обработанными столбняком DC (через CD28 и B7, комплекс TCR-CD4 и молекул главного комплекса гистосовместимости класса II (MHC) – рис. 2 - I,G) был проведен клеточный иммуноферментный анализ ELI-Spot в присутствии и в отсутствии проспидина.

3.3. Возможное воздействие проспидина непосредственно на T-лимфоциты

Для исследования возможного эффекта проспидина на T- клетки (рис. 2 - B), был проведен анализ методом ELI-Spot с использованием уже дифференцированных и обработанных столбняком DC, которые совместно инкубировали с предварительно инкубированными проспидином лимфоцитами CD4+.

Предварительные данные последних двух экспериментальных подходов (3.2., 3.3.) указывают на минимальное влияние проспидина на T-лимфоциты, однако эти результаты должны быть подтверждены в ходе дальнейших экспериментов.

4. Влияние проспидина на индукцию апоптоза у лимфоцитов

Способность проспидина, вызывать апоптоз (в зависимости от времени и дозы) в субпопуляциях лимфоцитов была проверена при помощи комплекта флуоресцентной индикации апоптоза Annexin V-FITC. Для этого CD3 позитивные T-лимфоциты (стимулированные фитогемаглютинином), а также CD 19 позитивными B-лимфоцитами (стимулированными anti-IgM) инкубировали на протяжении 3 дней с добавлением различных концентраций проспидина. Параллельно клетки обрабатывались дексаметазоном, который, как доказано, вызывает у лимфоцитов смерть. С интервалом в 12 часов соединение Annexin V определялось методом проточной цитометрии. Если в Т-клетках проспидин апоптоза не вызвал, то у В – лимфоцитов были засвидетельствованы признаки апоптоза.

Для получения полной картины иммунологического воздействия проспидина необходимо изучить действие лекарственных средств на клеточные пролиферативные ответы и синтез иммуноглобулин B-клеток (стимулированный anti-IgM), а также производство цитокина T-клеток (согласно PHA или anti-CD3 / CD28 костимуляции). Чтобы получить информацию о взаимодействии препарата с клетками, представляющими антиген, в дальнейшем необходимо изучить влияние проспидина на представление антигена MHC класса I и представления антигена класса II MHC в субпопуляциях Th2-лимфоцитов.

A - созревание DC из клеток - предшественников

AI – фенотипическое созревание

A2 – функциональное созревание

B – прямые антипролиферативные воздействия

       на T-клетки

C – Способность поглощения антигена

       антиген-представляющими клетками

D – процессинг (обработка ) антигена

E – образование комплекса MHC класса I и антигена

F – образование комплекса MHC класса I и антигена

G – Взаимодействие TCR-CD4 / MHC класса II

I -  взаимодействие TCR-CD8 / MHCC класса I

I – взаимодействие между B7 и CD28

K, L – Передача сигнала

Рисунок 2: Возможные точки воздействия проспидина в иммунной системе

На рисунке наглядно поясняется количество возможных взаимодействий проспидина (A1/A2/C/F). Для получения дополнительных данных с целью дальнейшей публикации необходимо провести следующие эксперименты:

1. Анализ взаимодействий между B- и T-лимфоцитами.

2. Анализ состава антигенов и MHC-молекулы.

3. Анализ транспорта ионов калия (Ca++) при активации антиген - специфической T- клетки.

4. Действие проспидина на ход реакции нуклеарного фактора каппа В (белка NFkB).

5. Клинические анализы больных инфектратритом