ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРОСПИДИНА С ХРОМАТИНОМ

Н. С. Богомолова, А. И. Горин.

О молекулярных .механизмах действия проспидина в настоящее время известно мало. Существует гипотеза об опосредованном действии этого препарата на функцию опухолевой клетки через плазматическую .мембрану [I]. Однако имеются данные, что проспидин (или его метаболиты) способен проникнуть в клетку и взаимодействовать с различными клеточными структурами (ядра, митохондрии, микросомы, цитоплазматические мембраны, гиалоплазма) [2], что, естественно, расширяет возможный спектр молекулярного действия проспидина. Например, показано, что в механизме цитостатического действия проспидина определенная роль принадлежит его реакции с тканевыми сульфгидрильными группами опухоли и нормальных тканей [З], что характерно также и для алкилирующих агентов [4].

Существенным звеном в механизме противоопухолевого действия многих цитостатических препаратов является их взаимодействие с генетическим аппаратом опухолевых клеток. По-видимому, это справедливо и для проспидина, так как рядом авторов показано, что проспидин в течение митоза способен вызывать различные .повреждения хромосом и митотического аппарата [5, 6, 7]. Однако прямые данные о взаимодействия проспидина с хроматином в литературе отсутствуют.

В настоящей работе мы изучали возможность связывания проспидина с хроматином и распределение проспидина между основными компонентами хроматина: ДНК, гистонами и негистоновыми белками. С этой целью меченый  ¹⁴С-проспидин (удельная активность 1,25 мкКи/г), растворенный в физиологическом растворе, однократно вводили внутривенно белым крысам в количестве 3 мкКи на одну мышь. Через 5 мин после инъекции проспидина из мышей извлекали печень и селезенку и выделяли из них ядра; которые служили источником выделения хроматина [8]. Хроматин выделяли в растворителе 5 мМ трис-НСl, рН 7,9 и 5 мМ ЭДТА. Для определения включенной радиоактивной метки ¹⁴С-проспидина хроматин гидролизовали, для чего к 0,5 мл исходного препарата добавляли 0,2 -мл 56% -ной хлорной кислоты и 0,4 мл 30%-ной перекиси водорода. Смесь прогревали при 80° С в течение 1 ч; 1,1 мл гидролизата переносили во флаконы с 8 мл сцинтилляционной жидкости (толуол, РРО, метилцелозольв). Активность измеряли на счетчике «Intertechnique» (Франция). Данные по включению радиоактивной метки в хроматин представлены в табл. 1.

Таблица 1

Включение ¹⁴С-проспидина в хроматин

* сырая масса печени 2 г; хроматин, выделенный в объеме 20 мл с концентрацией ДНК 510 мкг/мл, белок 1550 мкг/мл.

** сырая масса селезенки 880 мг; хроматин, выделенный в объеме 20 мл с концентрацией ДНК 830 мкг/мл, белок 1200 мкг/мл. ДНК определяли спектрофотометрически по методу Спирина, белок определяли по методу Лоури [10, 11].

После депротеинизации исходного хроматина в присутствии 5 М мочевины и 3 М NаСl и осаждения ДНК центрифугированием в течение 24 ч при 200 000 g (центрифуга «Spinco L5») обнаружено, что в ДНК хроматина селезенки и печени включается, соответственно, 13 и 10% радиоактивной метки (радиоактивность исходного хроматина принята за 100%). Остальное количество ¹⁴С-проопидина включается в белковый компонент хроматина. Однако не исключено, что при внутривенном введении препарата включение проспидина в различные клеточные структуры и, в частности в хроматин, может быть обусловлено реакциями метаболизма.

Поскольку при различных физико-химических исследованиях нас интересует возможность непосредственного взаимодействия проспидина с хроматином, мы провели серию экспериментов в условиях  in vitro после инкубации суспензии ядер с ¹⁴С-проспидином.

При инкубации в течение 2 ч при 37° С ядер, выделенных из селезенки (концентрация -проспидина 0,01 М), показано, что в гистоновые белки (выделены из хроматина методом кислой экстракции в 0,2 N НСl) включается ~21,6% радиоактивной метки, а в негистоновые белки (выделены из хроматина методом щелочной экстракции в 1,0 N NаОН)—71% от общей радиоактивности хроматина.

Таким образом, можно сделать вывод, что проспидин как при внутривенном введении мышам, так и при инкубации с ядрами in vitro вступает во взаимодействие с компонентами хроматина. Связь молекул проспидина с хроматином, по-видимому, весьма прочная, так как проспидин остается связанным с хроматином несмотря на ряд сложных процедур различных отмывок, которые неизбежны при выделении хроматина из клеток.

Другим важным выводом является то, что проспидин реагирует в основном с белковым компонентом хроматина. Известно, что белки хроматина выполняют различные структурную и регуляторную функции. Нарушение структурной организации хроматина проявляется в образовании одиночных разрывов полинуклеотидных тяжей ДНК, в ослаблении 6елково-нуклеиновых взаимодействий в дезоксирибонуклеопротеидных комплексах и в нарушении образования искусственных комплексов ДНК-гистон [10]. Следовательно, можно предполагать, что физиологический эффект хроматина может проявиться и на регуляторном уровне работы генетического аппарата клетки. Этот вопрос подлежит дальнейшему изучению на опухолевых препаратах.

ЛИТЕРАТУРА

1. Чернов В. А., Геодакян С. В.—Хим.-фарм. ж., 1976, № 12, с. 7—13.

2. К вопросу о механизме действия проспкдина./Сускова В. С., Серебряков Н. Г., Чернов В. А., Богомолова Н. С., Муховатова Л. М. — В кн.: Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей. Черноголовка, 1980, т. I, с. 145—148.

3. Кулик Г, И., Король В. И., Лукьяненко М. В. К механизму цитотоксического действия проспидина.—В кн.: Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей. Черноголовка, 1980, с. I, с. 155—158.

4. Кулик Г. И. К механизму цитотоксического действия алкилируюших противоопухолевых препаратов и лекарственной устойчивости к ним. Автореф. докт. диссертации, Киев, 1972.

5. Ершова Ю. А., Минакова С. М., Чернов В. А. Влияние проспидина на митотическую активность опухолевой и нормальной тканей. — В кн.: Проспидин—новое противоопухолевое средство (Сборник трудов ВНИХФИ, вып. .3). М., 1973, с. 36—39.

6. Действие противоопухолевых препаратов дипина и проспидина на клеточный цикл гепатоцитов в регенерирующей печени мышей./Фактор В. М.