БЮЛЛЕТЕНЬ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЫ, ТОМ ХС1Н, № 3, 1982, стр. 79 - 81

ВЛИЯНИЕ ПРОСПИДИНА НА УЛЬТРАСТРУКТУРУ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

М. В. Манджгаладзе, В. Л. Попов, В. А, Чернов

Разработанный во ВНИХФИ им. С. Орджоникидзе оригинальный противоопухолевый препарат проспидин — дихлорид N,N'"-ди-(γ-хлор-β-оксипропил)-N'N"-диспиротрипиперазиния — применяется в онкологической практике при лечении ряда злокачественных новообразований [51. Его молекула содержит γ-хлор-β-оксипропильную  группировку, способную алкилировать биологические субстраты. Однако в ряде работ было показано, что проспидин отличается от известных антибластических лекарственных средств из группы алкилирующих агентов как по фармакологическим свойствам (незначительная токсичность, большая терапевтическая широта, отсутствие угнетающего действия на кроветворение), так и по влиянию на многие внутриклеточные процессы (клеточный цикл, синтез ДНК, гликолиз и дыхание, влияние на плазматические мембраны и т. д.) 12—б]. Очевидно, что проспидин обладает своеобразным механизмом противоопухолевого действия, который в настоящее время еще недостаточно ясен.

В связи с изложенным представляло интерес изучить влияние проспидина на ультраструктуру опухолевых клеток с целью выявления характера и последовательности изменений субклеточных органелл, что может оказаться полезным для понимания его механизма действия.

Методика исследования. Объектом исследования служила перевиваемая крысиная саркома 45, обладающая средней чувствительностью к проспидину. Препарат вводили внутрибрюшинно на б — 7-е сутки после подкожной перевивки суспензии клеток саркомы 45. В соответствующее время крыс декапитировали.

Проведены 2 серии опытов с применением следующих доз проспидина: 1) 1000 мг/кг, однократно — максимально переносимая доза (МПД), приводящая к торможению роста опухоли на 50—60%; 2) по 145 мг/кг ежедневно в течение 10 сут  —  терапевтическая доза, вызывающая торможение роста опухоли на 60—70%.

При применении МПД ткань для исследования брали спустя 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96 и 120 ч после введения, а при использовании многократной терапевтической дозы кусочки опухоли фиксировали спустя 24 ч после каждого введения и через 48 ч после окончания курса лечения. На каждый срок брали материал не менее чем от 4 животных.

Кусочки опухолевой ткани объемом 1 мм³ брали с периферии сар коматозного узла во избежание попадания спонтанных очагов некроза. Фиксацию проводили в 2,5% растворе глутаральдегида с последующей дофиксацией в 1% растворе ОsO₄  на фосфатном буфере. После обезвоживания в этаноле кусочки опухолевой ткани заливали в аралдит. С каждого залитого кусочка, прежде чем получить ультратонкие срезы, делали срезы толщиной 0,5—1,0 мкм, окрашивали их метиленовым синим и просматривали в световом микроскопе. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме марки LKB. Срезы, контрастированные уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали в электронном микроскопе 1ЕМ-7 или 1ЕМ-100В.

Результаты исследования. Электронно-микроскопическое исследование показало, что интактная ткань саркомы 45 характеризуется полиморфизмом клеточного состава. Плотно прилегающие друг к другу клетки отличаются между собой по форме, электронной плотности нуклео- и цитоплазматического матрикса, а также по выраженности внутриклеточных органоидов.  Большинство из клеток периферической зоны опухоли характеризуется средней электронной плотностью основного вещества цитоплазмы. Ядро с диффузно распределенным хроматином и сильно развитым ядрышком занимает значительную часть клетки. В цитоплазме клеток присутствуют слегка набухшие митохондрии и значительное количество свободных рибосом. Гранулярная эндоплазматическая сеть и внутриклеточный пластинчатый комплекс относительно нормальной структуры. Необходимо отметить, что в интактных клетках саркомы 45 почти полностью отсутствуют жировые включения и лизосомы.

Рис. 1. Изменение ультраструктуры опухолевой клетки под влиянием проспидина.

К — интактная опухолевая клетка, а — реактивное изменение опухолевой клетки, б — вакуолизация митохондрии и эндоплазматической сети, осмиофилия, изменение ядерных элементов клетки; в — деструкция опухолевой клетки. I — период от 12 до 48 ч с момента введения МПД и после 3—5 инъекции терапевтической дозы; II — период от 72 до 96 ч с момента введения МПД и после 6—8 инъекции терапевтической дозы: III— после 120 ч с момента введения МПД и спустя 48 ч после окончания введения терапевтической дозы.

В ранние сроки после введения проспидина (через 3 и 6 ч при МПД и через 24 ч после двух первых инъекций при терапевтической дозе) ультраструктура клеток не отличалась от контроля. В период от 12 до 48 ч с момента введения МПД и после 3—5 инъекций при многократных дозах в

Рис. 2. Изменение ультраструктуры клетки саркомы 45 после 72 ч воздействия проспидина в дозе 1000 мг/кг.

Ув. 10 500. Здесь и на рис. 3 Я — ядро, Яд — ядрышко, М — митохондрия, ГЭР — гранулярный эндоплазматический ретикулум.

Рис. 3. Изменение ультраструктуры клетки саркомы 45 после 10-кратного введения проспидина в дозе 145 мг/кг. Ув. 16 500.

большинстве клеток наступали реактивные изменения   цитоплазматических компонентов и, в частности, набухание митохондрий с частичной редукцией крист и просветлением матрикса, а также некоторое расширение канальцев эндоплазматической сети (рис. 1, а). В последующие сроки ультраструктурные изменения усиливались, вплоть до глубоких форм клеточного поражения. От 72 до 96 ч с момента введения МПД и после 6—8 инъекций при многократных дозах в большинстве клеток исследуемой зоны опухоли происходит процесс вакуолизации цитоплазмы за счет канальцев гранулярной эндоплазматической сети. Вакуолизация сочетается с повышением осмиофилии основного вещества цитоплазмы и деструкцией митохондрий. В более поздние сроки наблюдается углубление процессов вакуолизации внутриклеточных мембранных элементов клеток. Полости эндоплазматической сети расширяются до такой степени, что порой образуют причудливые узоры за счет целых комплексов мембранных структур (рис. 1, б и 2). К этому времени изменяются и ядерные элементы клеток (изменяется форма ядер, расширяется перинуклеарная цистерна, хроматин располагается на периферии ядра, в ядрышках прослеживается преобладание фибриллярного компонента над гранулярным). В цитоплазме клеток появляются жировые включения и лизосомы. После 120 ч с момента введения МПД и спустя 48 ч после окончания курса лечения большинство клеток периферической зоны опухоли подвергается распаду (рис. 1, в и 3).

Таким образом, описанные изменения ультраструктуры клеток отражают способность препарата воздействовать как на энергетику (влияние на митохондрии), так и на белоксинтезирующий аппарат опухолевой клетки (влияние на гранулярный эндоплазматический ретикулум), что в итоге приводит к потере жизнеспособности большинства клеток саркомы 45. В то же время изменение клеток, сопровождающееся вакуолизацией гранулярной эндоплазматической сети, является, по нашему мнению, выражением специфичности влияния проспидина на ультраструктуру опухолевой клетки. Подобный тип изменения субмикроскопической морфологии не характерен ни для одного из изученных в этом плане противоопухолевых веществ, хотя похожие изменения клеток встречаются при воздействии некоторых других повреждающих факторов [9, 10]. Как известно из опубликованных работ [3, 8], проспидин избирательно воздействует на плазматическую мембрану опухолевых клеток. Принимая во внимание тот факт, что комплекс внутриклеточных мембран является единой системой, в состав которой входит гранулярная и агранулярная сеть, соединенная анастомозами с перинуклеарной цистерной и окружающей клетку мембраной, нарушение проницаемости или какое-либо другое изменение свойств плазматической мембраны влечет за собой перестройку и деформацию внутриклеточных мембранных систем, осуществляющих в клетке ряд жизненно важных функций. Вследствие нарушения этих функций изменяется общий гомеостаз клетки, что приводит к снижению синтетической способности ядра. Морфологически это выражается в отеке, перераспределении хроматина и редукции гранулярного компонента ядрышка [1, 7]. Прямое влияние проспидина на ядерные ультраструктуры нам представляется менее вероятным, так как их повреждение наступает в поздние сроки воздействия.

Таким образом, имеющиеся в литературе данные о необычных чертах механизма действия проспидина находят свое отражение и во влиянии данного препарата на ультраструктуру опухолевых клеток. Результаты наших опытов подтверждают представление об оригинальном механизме действия проспидина и, в частности, об участии в нем мембранных структур.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бернар В.—В кн.: Клеточное ядро—морфология, физиология, биохимия. М., 1972, с. 19—20.

2. Богомолова Н. С. Чернов В. А. — В кн.: Проспидин — новое противоопухолевое средство, М., 1973, с.74—77.

3. Геодакян С. В., Горин А. И., Цейтлин П. И. и др. — Хим.-фарм. ж., 1978, № 9, с. 7—12.

4. Ершова Ю. А., Минакова С. М., Чернов В. А. к др. — В кн.: Вопросы радиобиологии и биологического действия цитостатических препаратов. Томск, 1977, с. 157—160.

5. Проспидин — новое    противоопухолевое средство. Под ред. В. А. Чернова. М., 1973, с. 92—226.

6. Фактор В. М., Соколова Л. С., Урыеаева И. В. и др. — Хим.-фарм. ж., 1976, № 10, с. 11—16.

7. Чепцов Ю. С., Поляков В. Ю. — В кн.: Ультраструктура клеточного ядра. М., 1974, с. 155.

8. Чернов В. А., Геодакян С. В. — Хим.-фарм. ж., 1966, № 12, с. 7—13.

9. Bassi Af., Bernelli N. Zazzera A. — Exp. molec. Path., 1964, v. 3, p. 332—350.

10. Caulfield J., Klionsky B. — Am. J. Path., 1959, v. 35, p. 489.