РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

ИМ. Н.Н.БЛОХИНА

 НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОТЧЕТ ПО ТЕМЕ

 «ИЗУЧЕНИЕ АНТИАНГИОГЕННЫХ СВОЙСТВ ПРОСПИДИНА»

 Москва 2005 год

Е.В. Степанова

Старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН, к.м.н.

Несмотря на несомненные успехи в химиотерапевтическом лечении злокачественных новообразований, требуется дальнейшая разработка новых подходов к эффективной  терапии злокачественных опухолей. Среди них – антиангиогенная терапия, направленная на блокирование роста новых микрососудов. Ингибиторы ангиогенеза способны останавливать рост опухоли, «нормализовать» хаотичные сосуды внутри опухоли и частично снижать лекарственную резистентность за счет увеличения биодоступности химиопрепаратов.

Ангиогенез – формирование новых микрососудов из уже существующих микрососудов. Недостаток в питательных веществах и кислороде, необходимых для роста опухоли, приводит к появлению клонов опухолевых клеток, выделяющих ангиогенные факторы. Высокоангиогенные опухоли имеют больше возможностей индуцировать рост новых сосудов при метастазировании, по сравнению с низкоангиогенными, метастазирующие клоны которых находятся в «дремлющем» состоянии. Экспериментальные исследования in vivo, иммуногистохимические и биохимические исследования различных опухолей человека неоднократно демонстрировали зависимость роста опухоли и метастазирования от ангиогенной активности первичного очага. На основе данных о важности процесса ангиогенеза для развития и прогрессии опухоли была предложена новая стратегия лечения злокачественных новообразований:  антиангиогенная терапия – терапия, направленная на блокирование роста новых микрососудов в опухоли.

Неоангиогенез опухолей является сложным комплексным процессом, в который вовлечено большое количество генов и белков. Манипулирование им требует тщательного выбора мишеней для воздействия. Это могут быть и матриксные металлопротеиназы, и VEGF, и bFGF, и их рецепторы и множество других критических для неоангиогенеза факторов. Комбинированное воздействие на эти механизмы позволит эффективно блокировать образование новых сосудов и вызывать регрессию уже сформированных сосудов внутри опухоли.

Появляется все больше экспериментальных данных, что ингибирование ангиогенеза является одним из компонентов противоопухолевой активности многих традиционных цитотоксических препаратов (например, блеомицина, циклофосфамина, доксорубицина, нитрозомочевины и т.д.). Противоопухолевые препараты воздействуют на делящиеся эндотелиальные клетки  также как и на опухолевые. Однако эндотелиальные клетки способны восстановиться в течение традиционного перерыва  (2-3 недели), который обычно используется в химиотерапии для восстановления функции костного мозга. Исследования, проведенные на мышах, убедительно показывают, что использование «антиангиогенного режима» введения циклофосфамида – частое введение небольшими дозами – имеет преимущество перед традиционным режимом введения препарата. Кроме того, в этих экспериментах не наблюдалось появление резистентности к препарату, в отличие от традиционного введения. Имеется лишь небольшое количество клинических примеров использования «антиангиогенного режима введения» препаратов.

Дальнейшая разработка «антиангиогенных режимов» использования традиционных противоопухолевых препаратов является актуальной и требует тщательного изучения.

ПРОСПИДИН (Рrospidinum) – N,N 111 -бис(2-Гидрокси-3-хлорпропил)- N,N 11 -диспиротрипиперазиния дихлорид, моногидрат. Легко растворим в воде, практически нерастворим в спирте; рН 2 % водного раствора 6,0 - 7,0. По химическому строению проспидин имеет некоторое сходство с бис- ( b -хлорэтил)-аминами, однако существенно отличается тем, что сложная гетероциклическая часть его молекулы содержит четвертичные атомы азота, а вместо хлорэтильных радикалов содержатся хлороксипропильные группы, присоединенные к двум полярно расположенным атомам азота. Проспидин является активным противоопухолевым препаратом. В отличие от других цитостатических препаратов не оказывает в лечебных дозах выраженного угнетающего влияния на кроветворение. Как и другие цитостатические препараты, проспидин обладает иммунодепрессивными свойствами. Основными показаниями к применению проспидина являются рак гортани и злокачественные новообразования глотки. Более чувствительны к препарату экзофитно растущие и гистологически малодифференцированные новообразования. Препарат эффективен также при папилломатозе верхних дыхательных путей (применяют преимущественно при распространенном, часто рецидивирующем процессе в гортани, трахее, полости носа и придаточных пазухах), при раке легких, лимфогранулематозе, при ретикулезах кожи (ангиоретикулез Капоши, грибовидный микоз, саркоматоз кожи), пузырчатке, ретинобластомах. Высокая эффективность препарата при ангисаркоме Капоши предполагает, что проспидин может ингибировать ангиогенные механизмы внутри опухоли. 

Для изучения антиангиогенных свойств различных веществ используются стандартные тесты, которые дают возможность оценки влияние исследуемых веществ на ключевые параметры, характеризующие рост сосудов (bFGF-зависимая пролиферация и миграция клеток эндотелия и образование капилляр-подобных структур) (Табл.1). Используя эти методы, возможно адекватно оценить влияние препаратов на основные этапы формирования кровеносных сосудов внутри опухоли. Определение антиангиогенного потенциала веществ in vitro проводится с использованием культуры эндотелиальных клеток мыши (SVEC-4-10).

 Целью научно-исследовательской работы является изучение антиангиогенной активности препарата Проспидин in vitro.

Таблица 1.

Методы скрининга антиангиогенных веществ in vitro

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10, трансформированная вирсусом SV40 [Walter-Yohrling J., et al. Clin Cancer Res 2004;10:2179–2189].

В качестве препарата использовались ампулы Проспидина лиофилизированного (0,1г для инъекций). Препарат разводился в стерильной дистиллированной воде непосредственно перед каждым опытом.

Изучение антиангиогенного действия препарата проводили с использованием следующих методик. 

Цитотоксическое действие на  культуру эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10

Клетки (10т/лунка) сажали на 96-луночный планшет в среде ДMEM, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, 2мМ. Через 24 часа добавляли препарат в различных концентрациях (1-0,0001 мг/мл). После 24 часов инкубации с препаратом добавляли МТТ в конечной концентрации 0,5 мг/мл. Клетки инкубировали 4 часа, затем среду отбирали и клетки растворяли в ДМСО. Оптическую плотность оценивали на анализаторе иммуноферментных реакций «Униплан» при 540 нм, используя DMSO как нулевой контроль. 

Данный метод позволяет оценить цитотоксическое действие  препарата на эндотелиальные клетки.

 Ингибирование bFGF стимулированной пролиферации культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10

Клетки (3т/лунка) сажали на 96-луночный планшет в среде ДMEM, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, 2мМ глутамина и 20 нг/мл bFGF. Спустя 24 часа добавляли препарат в различных концентрациях (1-0,0001 мг/мл). Инкубацию с препаратом проводили 3 дня, затем добавляли МТТ в конечной концентрации 0,5 мг/мл. Клетки инкубировали 4 часа, затем среду отбирали и клетки растворяли в ДМСО. Оптическую плотность оценивали на анализаторе иммуноферментных реакций «Униплан» при 540 нм, используя DMSO как нулевой контроль. 

Данный метод позволяет оценить влияние препарата на пролиферативную активность активированных эндотелиальных клеток.

 Ингибирование миграции культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10 (метод «раневой поверхности»).

Клетки (150т/лунка) сажали на 24 луночный планшет в среде ДMEM содержащей 10% эмбриональной сыворотки, 2мМ глутамина, и инкубировали до образования монослоя. Затем монослой нарушался путем соскабливания части клеток. В течение 24 часов клетки инкубировались в среде ДМЕМ, содержащей 10% FCS, 2мМ глутамина и нецитотоксические дозы препарата. В качестве положительного контроля использовались клетки, инкубировавшиеся в ДМЕМ без добавления сыворотки.  Результаты оценивали как процент мигрирующих клеток в опыте по отношению к контролю (клетки в среде ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, 2мМ глутамина).

Метод позволяет оценить влияние препарата на миграцию эндотелиальных клеток внутри опухоли.

 Ингибирование образования трубочко-подобных структур эндотелиальными клетками SVEC-4-10.

24-луночную плашку покрывали раствором Матригеля (250 мкл/лунка) и инкубировали 20 минут при 37⁰С до его полимеризации. Клетки (200 т/500 мкл) инкубировали в среде ДМЕМ с добавлением нецитотоксических доз препарата в течение 30 минут при 37⁰С. Затем клетки (500 мкл) наносили в лунки, покрытые Матригелем, и инкубировали в СО₂-инкубаторе в течение 4-5 часов. В качестве положительного контроля использовали клетки, инкубировавшиеся в среде ДМЕМ без добавления препарата. Оценивали длину трубочек и количество контактов между трубочками.

Данный метод позволяет оценить влияние препарата на формирование первичной капиллярной сети внутри опухоли.

 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

 Было исследовано влияние препарата Проспидин на гибель, пролиферацию, миграцию эндотелиальных клеток SVEC-4-10 и формирование трубочко-подобных структур в концентрациях 1-0,0001 мг/мл. Экспериментальные данные по каждой концентрации были получены в дуплетах/триплетах в трех независимых экспериментах.

Проведенное исследование показало, что Проспидин не оказывает цитотоксического действия на культуру эндотелиальных клеток  SVEC-4-10 в изученных концентрациях (1-0,0001 мг/мл). Во всех изученных концентрациях выживаемость клеток, после инкубации с препаратом, составляла 90-100% от клеток, которые инкубировались в чистой среде ДМЕМ. Однако Проспидин блокировал пролиферацию bFGF-активированных эндотелиальных клеток в концентрациях 1-0,05 мг/мл (ИК₅₀=0,5+0,12 мг/мл) (Рис. 1).  

 Рисунок 1. Цитотоксическое и антипролиферативное действие препарата Проспидин на культуру эндотелиальных клеток SVEC-4-10.

 Мы изучили влияние препарата на миграционную способность эндотелиальных клеток SVEC-4-10 в нецитотоксических концентрациях. При тестировании клеток с помощью метода «раневой поверхности», показано, что Проспидин блокирует миграцию эндотелиальных клеток в концентрации 1 мг/мл на 70% (Рис. 2). При концентрации 0,1 мг/мл и ниже ширина миграционной поверхности была сравнима с контрольным образцом. Данные о влиянии препарата на миграцию в данном тесте представлены в таблице 2.

Оценено влияние нецитотоксических доз препарата на формирование трубочко-подобных структур. Показано, что Проспидин частично блокирует образование трубочко-подобных структур в концентрациях 0,5 и 0,1 мг/мл (Рис. 3). Наблюдаемые трубочки являются короткими и прерывистыми («незакрытыми»), т.е. не ограничены контактами с другими трубочками. При концентрациях препарата 0,05 мг/мл и 0,01 мг/мл не обнаружено существенных отличий от контрольных опытов. Образовавшиеся трубочки не имеют существенных отличий от контрольных образцов: трубочко-подобные структуры высоко структурированы, ярко выражены, контактируют с другими трубочко-подобными структурами.  

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Препарат Проспидин блокирует  bFGF-стимулированную пролиферацию клеток SVEC-4-10 в концентрациях 1-0,05 мг/мл (ИК₅₀=0,5+0,12 мг/мл) без выраженного цитотоксического эффекта. Проспидин (0,1 мг/мл) блокирует миграцию клеток SVEC-4-10 в методе «раневой поверхности» на 70%. Препарат в концентрациях 0,5-0,1 мг/мл блокирует образование трубочко-подобных структур.

Таким образом, в экспериментах in vitro было показано, что Проспидин ингибирует основные этапы опухолевого ангиогенеза: пролиферацию, миграцию и формирование капилляро-подобных структур в концентрациях до 0,1 мг/мл.

А      Б

Рисунок 2. Микрофотографии результатов теста на влияние на миграцию культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10 (метод «раневой поверхности»). А. контрольный образец (клетки без препарата). Б. клетки, инкубировавшиеся с препаратом Проспидин в концентрации 0,1 мг/мл.

 Таблица 2.

Влияние препарата Проспидин

на миграцию культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10

А        Б  

В         Г  

Рисунок 3. Микрофотографии трубочко-подобных структур, сформированных эндотелиальными клетками. А. контрольные клетки (без препарата). Б. клетки, инкубировавшиеся с препаратом Проспидин в концентрации 0,5 мг/мл. В. клетки, инкубировавшиеся с препаратом Проспидин в концентрации 0,1 мг/мл. Г. клетки, инкубировавшиеся с препаратом Проспидин в концентрации 0,05мг/мл.