АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ХИМИОТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ, Свердловск, 1982, Черноголовка 1982, материалы совещания, стр. 122 - 124

ВЛИЯНИЕ ПРОСПИДИНА НА ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСА ДНК—ГИСТОН

Н. С. БОГОМОЛОВА, А. И. ГОРИН, В. А. ЧЕРНОВ, П. И. ЦЕЙТЛИН

(Всесоюзный научно-исследовательский химико-фармацевтический институт им. С. Орджоникидзе, Институт медицинской генетики АМН СССР, Москва)

В настоящей работе исследовали распределение проспидина между основными компонентами дезоксирибонуклеопротеидного комплекса, а также влияние препарата на образование нерастворимого комплекса в 0,14 М NаСl.

С этой целью проспидин, меченный по ¹⁴С (удельная активность1,25 мкюри/г), вводили внутривенно белым беспородным мышам в концентрации 3 мг/мышь. Через 5 минут после введения препарата животных забивали. Хроматин выделяли из печени и селезенки [I]. Полученные данные по включению радиоактивной метки характеризуют прочное связывание проспидина с хроматином. Если уровень радиоактивности гомогената печени принимать за 100%, то оказывается, что с хроматином, выделенным из ядер печени, связывается не менее 13,2% радиоактивной метки. При выделении хроматина из ядер селезенки эта величина составляет примерно 10%. Следует отметить, что уровень включения радиоактивной метки проспидина в хроматин, выделенный из тканей здоровых животных, удовлетворительно совпадает с количественным содержанием меченого проспидина в ядрах, выделенных из печени и селезенки крыс с саркомой 45, забитых также через 5 минут после внутривенного введения проспидина-¹⁴С.

После центрифугирования хроматина в диссоциирующей системе (3 М NаСl и 5 М мочевины) в режиме осаждения ДНК — 200000 g, 24 часа — показано, что с ДНК хроматина печени связывается не менее 10% радиоактивной метки, включенной в хроматин, а с ДНК хроматина селезенки — не менее 19,2%. Белковый компонент хроматина печени и селезенки также по-разному включает метку проспидина. Если в супернатанте с белковой фракцией хроматина селезенки практически полностью связывается радиоактивная метка и в значительно меньшей степени она связывается с ДНК, то из белковой фракции хроматина печени большая часть проспидина теряется во время диализа супернатантной фракции в процессе освобождения от ЗМ NаС1 и 5М мочевины. В настоящее время не представляется возможным обсудить причину различного связывания проспидина с ДНК и белком печени и селезенки. Не исключено, что это связано с особенностями структурной организации хроматина.

При инкубации очищенных ядер селезенки с проспидином показано, что в условиях in vivo препарат также проникает в ядро и связывается с хроматином. В этом случае наблюдали распределение радиоактивной метки между компонентами хроматина в следующем соотношении (активность хроматина принята за 100%): ДНК ~ 25, белки, экстрагируемые в 0,2Н НCl ~ 21; белки, экстрагируемые в 1,ОН NaСl ~ 47 и нерастворимая после экстракций фракция  ~ 7%.

Приведенные данные однозначно показывают, что проспидин связывается с основными компонентами хроматина: ДНК и белком как in vivo при внутривенном введении препарата мышам, так и in vitro. Во всех случаях значительно большая часть радиоактивной метки связывается с белковой компонентой.

Поскольку гистоны играют важную роль в образовании нуклеосомных структур, представляло интерес выяснить, влияет ли взаимодействие проспидина с гистонами и ДНК на их комплексообразование. С этой целью получали искусственные комплексы ДНК — гистон после предварительной инкубации каждого компонента с проспидином. В работе использовали ДНК и суммарный гистон, выделенные из тимуса теленка. Комплексы ДНК—гистон в соотношении 1:2 получали в 0,14М NaСl, суспензию центрифугировали при 114000 g 6 часов, комплекс осаждали, а супернатантную фракцию анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле по Лэммли. Электрофорез проводили в трубочках размером 12 см при силе тока на одну трубочку 3 ма.

Как видно из представленных электрофореграмм (рисунок), инкубация гистонов и ДНК с проспидином существенно препятствует комплексообразованию, что ярче проявляется при предварительной обработке гистонов. Эти экспериментальные данные однозначно подтверждают вывод, полученный нами ранее методом изучения температурной зависимости вязкости, что проспидин при взаимодействии с дезоксирибонуклеопротеидным комплексом вызывает ослабление связей ДНК—белок [2].

Электрофоретический анализ гистонов в надосадочной жидкости:

а) 1 — суммарный гистон без ДНК; 2—суммарный гистон + ДНК; 3 —  суммарный гистон + проспидин + ДНК;

6} 1 — суммарный гистон без ДНК; 2 — ДНК + суммарный гистон; 3 — ДНК + проспидин + суммарный гистон

Из экспериментов по изучению включения радиоактивной метки ¹⁴С-проспидина при инкубации препарата с ДНК или гистонами в условиях in vitro следует, что одна молекула проспидина включается либо на 18 пар азотистых оснований, либо на 100 аминокислотных остатков.

Таким образом, результаты настоящей работы показывают, что проспидин как в условиях in vivo при внутривенном введении мышам, так и в условиях in vitro при инкубации либо с ДНК, либо с гистоном взаимодействует с основными компонентами хроматина, что может препятствовать образованию комплексов ДНК—гистон.

ЛИТЕРАТУРА

1. Н. С. Богомолова, С. В. Геодакян,  А. И. Горин, В. А. Чернов, П. И. Цейтлин. В сб.: «Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапия опухолей». Материалы Всесоюзного совещания. Черноголовка, 1980, 1, стр. 152.

2. В. С. Сускова, Н. Г. Серебряков,В. А. Чернов, Н. С. Богомолова, Л. М. Муховатова. В сб.: «Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей». Материалы Всесоюзного совещания.   Черноголовка, 1980, 1, стр. 145.

3. С. В. Геодакян, А. И. Горин, П. И. Цейтлин, В. А. Чернов. «Хим.-фарм. ж.», 1978, XII, № 9, стр. 22.