Гистологическое и иммуногистохимическое исследование действия препарата проспидина на перевиваемую меланому В16

Настоящее исследование выполнено в лаборатории комбинированной терапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

Проспидин вводили внутрибрюшинно в разовой дозе 250 мг/кг мышам самкам ВДF₁ с подкожно трансплантированной меланомой В16.

Препарат вводили на 2, 4, 6 день после трансплантации. Мышей забивали на 11 сутки после трансплантации.

В контрольной (без введения препарата) и опытной группе (с введением препарата) было по 3 мыши.

Кусочки опухоли заливали в парафин, готовили срезы, которые окрашивали гематоксилин-эозином для гистологического исследования.

С тех же кусочков готовили срезы для иммуногистохимического изучения маркеров ангиогенеза: эндотелиальных клеток – CD-31 и CD-34 и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).

Препараты просматривали и фотографировали в микроскопе «Поливар» (Австрия).

А. Гистологическое исследование (таблица № 1).

Контрольная группа (рис. 1 - 4). Опухоль состоит из крупных полиморфных клеток с округлыми или овальными ядрами преимущественно с диффузным хроматином.

Опухолевые клетки образуют сплошные разрастания, местами видны широкие тяжи.

В контрольной группе площадь некрозов не превышает 2-3% поверхности среза. Митозы встречаются г.о. на  периферии опухолевых разрастаний и составляют около 0,5-1,0%. Явления апоптоза не выражены (0,01-0,05%).

Отмечается достаточно обильное образование сосудов в виде отдельных очаговых скоплений в различных участках опухоли.

Количество сосудов (плотность распределения в очагах скопления) достигает 15-20. Отмечаются небольшие кровоизлияния.

В опухоли местами встречаются клетки, содержащие меланин, который так же скапливается в макрофагах в местах некрозов и строме.

Опытная группа (рис. 5-8). Опухолевые клетки полиморфные, крупные, местами они более мелкие с гиперхромными ядрами.

Площадь некрозов в среднем достигает 7-8% поверхности среза. В отдельных опухолевых узлах видны массивные или тотальные участки некроза.

Вокруг некрозов и окружающей стромальной ткани отмечается выраженный отек и кровоизлияния.

Митозы в пределах 0,5-1,0%, явления апоптоза не выражены (0,01-0,05%).

Наблюдается много или в умеренном количестве очагов скопления сосудов, количество сосудов в которых в среднем составляет 10-15. Отмечаются выраженные повреждения сосудов и участки кровоизлияний и отек окружающей ткани.

Встречаются опухолевые клетки и макрофаги с меланином, который иногда в очагах некроза лежит свободно.

Следует отметить, что некрозы выражены у 2  мышей из 3, у 1 мыши площадь некрозов и изменения сосудов развиты как у контрольных животных.

Результаты гистологического исследования опухолей в контрольной и опытной группе суммированы в таблице №1 и представлены на рис. 1-8.

Б. Иммуногистохимическое исследование (таблица №2).

Контрольная группа (рис. 9-11).

Активность VEGF в большинстве  опухолевых клеток высокая. Отдельные группы опухолевых клеток, образующие небольшие участки дают умеренную, слабую или отрицательную реакцию. В некоторых участках положительную реакцию имеют эндотелиальные клетки.

Активность CD-31 в эндотелии большинства сосудов различного калибра выражена сильно, реже она умеренная.

Активность CD-34. Высокая активность преобладает в большинстве сосудов различного калибра, реже она умеренная или слабая.

Опытная группа (рис. 12-14).

Активность VEGF в большинстве опухолевых клеток слабая или умеренная, часть опухолевых клеток имеет отрицательную реакцию.

Активность CD-31 в эндотелии большинства сосудов слабая или умеренная, иногда отрицательная.

Активность CD-34 в эндотелии сосудов различного калибра слабая или умеренная иногда отрицательная.

Описанные иммуногистохимические показатели ангиогенеза имеются в опухолях у 2 мышей из 3, у 1 мыши изменения в опухоли соответствуют опухолям в контрольной группе.

Результаты иммуногистохимического исследования опухолей в контрольной и опытной группах суммированы в таблице №2 и представлены на рис. 9-14.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты гистологического и иммуногистохимического исследования суммированы соответственно в таблицах №№ 1-2 и документированы рис.  1-14.

Препарат проспидин при внутрибрюшинном введении в дозе 250 мг/кг на 2, 4 и 6 сутки вызывает на 11 день в трансплантированной под кожу меланоме В16 увеличение площади некрозов примерно в 2,5-3 раза, увеличивает отек окружающей опухоль ткани, а также усиливает повреждение сосудов и образование кровоизлияний.

Проспидин так же снижает активность VEGF в опухолевых клетках и реакцию CD-31 и  CD-34 в эндотелиальных клетках сосудов в опухолевой ткани.

Таким образом, проведенное гистологическое и, особенно, иммуногистохимическое исследование может свидетельствовать о способности проспидина в определенной степени снижать неоангиогенез в опухоли и усиливать в ней процессы некроза, возможно вследствие повреждения кровеносных сосудов.

Следует отметить, что подобные изменения обнаружены у двух опытных мышей из трех.

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор                             Н.Т.Райхлин

Таблица №1

Гистологические изменения в мышиной меланоме В16 при введении препарата проспидина

Таблица №2

Иммуногистохимическое исследование изменений показателей ангиогенеза

(VEGF, CD-31, CD-34 ) в мышиной меланоме В16 при введении препарата проспидина

А. Гистологическое исследование

Рис. 1. Контроль. Опухоль состоит из крупных полиморфных клеток. Видны митозы. Х400

Рис. 2. Контроль. Некоторые опухолевые клетки содержат пигмент меланин. Видны группы сосудов с эритроцитами. Х200.

Рис.3. Контроль. Опухолевый узел, окруженный капсулой. В опухоли видны группы сосудов. Х100

Рис.4. Контроль. Участок опухоли с очагами скопления кровеносных сосудов. Х70.

Рис.5. Опыт. Опухолевые клетки полиморфные, различного размера с гиперхромными ядрами. Очаг скопления кровеносных сосудов. Х200.

Рис.6. Опыт. Разрастание крупных полиморфных клеток со светлыми ядрами. Очаги скопления сосудов. Х200

Рис.7. Опыт. Массивный некроз опухолевого узла. Опухолевые клетки сохранились только на периферии. В одном участке очаг скопления кровеносных сосудов. Х70

Рис.8. Опыт. Опухолевый узел с массивным некрозом и очагом скопления кровеносных сосудов с участками кровоизлияний. Х100.

Б. Иммуногистохимическое исследование

Рис.9. Контроль. VEGF. Высокая активность в большинстве опухолевых клеток. Х400

Рис.10. Контроль. CD-31. Высокая активность в эндотелии кровеносных сосудов различного калибра. Х400

Рис.11. Контроль. CD-34. Высокая активность в эндотелии кровеносных сосудов различного калибра. Х400

Рис.12. Опыт. VEGF. Умеренная активность в опухолевых клетках. Х400

Рис.13. Опыт. CD-31. Умеренная и слабая активность в эндотелии большинства кровеносных сосудов. Х400

Рис. 14. Опыт. CD-34. Умеренная активность в эндотелии кровеносных сосудов. Видны г.о. капилляры. Х400