ВЛИЯНИЕ ПРОСПИДИНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК В КУЛЬТУРЕ

Петров А.В., Пигарева Н.В., Симбирцев А.С.

ГНЦ НИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург

Введение. Несмотря на существенные успехи, достигнутые в лечении ревматических заболеваний, фармакотерапия этих болезней продолжает оставаться одним из наиболее сложных разделов клинической медицины. Это является  мощным стимулом для разработки новых лекарственных средств с противовоспалительной и иммуномодулирующей активностью. Для расширения возможностей базисной терапии ревматоидного артрита (РА) в 1981 году Бененсоном Е.В. и Немцовым Б.Ф. был предложен, апробирован и внедрен в клиническую практику   противоопухолевый  препарат проспидин [2]. 

Проспидин - (дихлорид)-N, N-g-хлор-b-оксипропил-N, N-диспиротрипиперазин) является производным ди(b-хлорэтил)-амина, создан во Всесоюзном научно-исследовательском химико-фармацевтическом институте и применяется в качестве средства противоопухолевой химиотерапии, а также как иммуносупрессивный препарат. Отмечена высокая клиническая эффективность препарата при раке мочевого пузыря и яичников, ретикулезе кожи, раке и папилломатозе гортани, раке легких, ангиоретикулезе Капоши, раке желудка и молочной железы, опухолях головного мозга [9].  В настоящее время проспидин является перспективным иммуносупрессивным препаратом для применения у больных с РА [3]. Есть данные об успешном применении проспидина в ревматологии при системной красной волчанке, анкилозирующем спондилоартрите, псориатическом артрите [5,10-12]. Наличие в молекуле проспидина четвертичных атомов азота снижает способность препарата проникать через биологические мембраны. C другой стороны показано, что препарат проявляет мембранотропную активность, которая выражается в стабилизации клеточной поверхности, уменьшении ионной проницаемости плазматической мембраны и объемной концентрации клеток [14]. Всеми без исключения авторами отмечается хорошая переносимость препарата, отсутствие выраженной токсичности, значительная терапевтическая широта, превосходящая другие цитостатические средства в 2-5 раз, связанная с особенностями фармакокинетики препарата и отсутствие угнетающего действия на систему кроветворения [5,10-12]. Проспидин обладает иммунодепрессивным действием, которое установлено в эксперименте по задержке развития контактного аллергического дерматита и сывороточной анафилаксии, снижение титров преципитинов и уровня  g-глобулинов, нормализацией белковых фракций крови, а также подавлением активности IgM-антителообразующих клеток мышей при иммунизации их эритроцитами барана [1]. Иммунодепрессивное действие проспидина на иммунные нарушения, свойственные РА, проявляется в нормализации соотношений Т- В-лимфоцитов, и Т-субпопуляций, снижением титров РФ, сывороточных иммуноглобулинов и циркулирующих противосиновиальных антител, уменьшении цитопатической и иммуноглобулинсинтезирующей активности лимфоцитов [3,4,6]. Наличие самостоятельного анальгетического, антиэксудативного и жаропонижающего действия проспидина подтверждено экспериментальными работами на модели асептического воспаления [13]. Это противовоспалительное действие наступает у проспидина позже (8-10-12 сутки), но сохраняется длительное время после отмены, что отличает проспидин от нестероидных противовоспалительных препаратов и позволяет отнести этот препарат к группе базисных, способность которых сохранять лечебный эффект после отмены считается одним из основных свойств. Недавно, в клинической офтальмологии  была установлена способность проспидина подавлять неоангиогенез, как при системном, так и при локальном применении [15].

Однако особенности иммуносупрессивного действия проспидина остаются до конца не изученными, в частности не исследовалось влияние проспидина на синтез провоспалительных цитокинов. В связи с этим целью настоящей работы стало изучение токсичности проспидина в отношении иммунокомпетентных клеток и исследование его влияния на некоторые показатели функциональной активности различных типов лейкоцитов.

Материалы и методы

Биологическую активность проспидина исследовали на первичных культурах клеток лимфоидных органов мышей линии СВА весом 18-20 г из питомника “Рапполово” РАМН, либо на клетках периферической крови здоровых доноров. В работе использованы клетки крови двух доноров, имевших условное лабораторное обозначение №628 и №629, которое далее использовано на всех рисунках.

Для получения клеточных суспензий спленоцитов или тимоцитов кусочки органа помещали в среду Игла и измельчали в стеклянном гомогенизаторе. Клеточную взвесь фильтровали через капроновый фильтр, эритроциты лизировали 0.83% раствором  NH₄Cl, клетки отмывали, ресуспендировали в среде Игла, содержащей 1% эмбриональной телячьей сыворотки.

            Для постановки реакции бластной трансформации лимфоцитов свежую гепаринизировнную кровь в количестве 0,6 мл разводили средой Игла с добавлением 2мМ глутамина и 80 мкг/мл в 5 раз и вносили по 100 мкл в 96-луночные круглодонные планшеты для иммунологического исследования вместе с митогеном фитогемагглютинином (ФГА), «Serva», в концентрации 15 мкг/мл. Изолированные как описано выше лимфоциты тимуса или селезенки мышей вносили в лунки планшетов в концентрации 1 млн и 0,2 млн, соответственно. Для индукции пролиферации тимоцитов и лимфоцитов селезенки мышей использовали конканавалин А в различных концентрациях. Планшеты с исследуемыми образцами культивировали в течение 72 часов при 37˚С и 5% СО₂  в СО₂-инкубаторе. За 16 часов до окончания инкубации вносили ³Н-тимидин в дозе 5 мкКи/мл. После завершения культивирования клетки снимали с помощью харвестра («Flow») на нитроцеллюлозные фильтры. Уровень бластной трансформации лимфоцитов в исследуемых образцах оценивали по интенсивности включения ³H-тимидина с помощью бета-счетчика («Rackbeta») и жидкостного сцинтиллятора и выражали в импульсах в минуту (имп/мин). Бласттрансформацию в отсутствии митогена расценивали как спонтанную.

Для оценки продукции цитокинов лейкоцитами человека свежую венозную кровь с гепарином (20 МЕ/мл) тщательно перемешивали и разводили в 5 раз средой RPMI 1640 с добавлением 2 мМ глутамина и 80 мкг/мл гентамицина, для этого к 0.6 мл крови добавляли 2.4 мл среды RPMI 1640. В качестве индуктора синтеза цитокинов использовали официнальный ЛПС-содержащий препарат «Продигиозан». Для приготовления рабочего раствора продигиозана смешивали 2,4 мл cреды RPMI 1640 и 800 мкл 0,005% раствора продигиозана, при этом в 100 мкл полученного раствора содержалось 1,0 мкг продигиозана. В 96-луночный планшет для культивирования клеток ("COSTAR") вносили индуктор по 100 мкл на лунку, в контрольные лунки (для оценки спонтанной продукции) вносили по 100 мкл среды RPMI 1640, затем во все лунки добавляли по 100 мкл разведенной крови.  Культивирование проводили при 37^оС в 5% СО₂ в течение 24 часов, после чего осторожно отбирали супернатанты и исследовали в иммуноферментном тесте. При необходимости супернатанты хранили  при -20°С. Уровни цитокинов в супернатантах клеточных культур определяли методом твердофазного ИФА, используя тест-системы ООО «Цитокин» согласно рекомендациям производителя [8].

            Статистическую обработку данных в работе проводили с использованием критерия Стьюдента. В таблицах приведены средние значения и ошибки среднего.

Результаты и обсуждение

Учитывая цитостатические свойства проспидина относительно опухолевых клеток, в настоящем исследовании в первую очередь проведена оценка его возможной токсичности в культурах нормальных лимфоцитов. Для этой цели использована первичная культура тимоцитов мыши. Тимоциты инкубировали 18 часов в присутствии возрастающих концентраций проспидина от 1 нг/мл до 10 мг/мл. После окончания инкубации в контроле живые клетки при оценке по методу исключению трипанового синего составляли 97%. При использовании всех указанных доз проспидина токсического действия препарата не наблюдалось, выживаемость тимоцитов составила 96-98%.

После этого была произведена оценка влияния проспидина на спонтанную пролиферацию клеток в первичных культурах лимфоцитов и культурах ряда трансформированных клеточных линий (Табл.1). Согласно полученным данным проспидин подавлял пролиферацию всех использованных типов клеток в дозах 1 и 10 мг/мл. Наиболее чувствительными к действию проспидина оказались тимоциты.

На следующем этапе исследования проведена оценка влияния проспидина на индуцированную пролиферацию лимфоидных клеток, существенно возрастающую по сравнению со спонтанной пролиферацией в результате стимуляции цитокинами либо митогенными лектинами. На рис. 1 и 2 представлены результаты изучения влияния проспидина в указанных концентрациях на пролиферацию изолированных тимоцитов мышей, стимулированную различными дозами КонА, а также КонА в сочетании с рекомбинантным IL-1 бета человека. Как следует из приведенных данных, проспидин вызывал полное дозозависимое снижение индуцированной пролиферации тимоцитов, причем, подавление пролиферации наблюдалось в дозах 1 и 10 мг/мл, что совпадает с результатами, полученными при изучении его влияния на показатели спонтанной пролиферации клеток. Те же закономерности обнаружены при изучении влияния проспидина на индуцированную пролиферацию лимфоцитов селезенки мышей не зависимо от индукторов пролиферации, в качестве которых использовались КонА в разных дозах и ЛПС E.coli (рис.3).

С другой стороны, при анализе влияния проспидина на пролиферацию лимфоцитов периферической крови человека в реакции бластной трансформации, индуцированной ФГА, выяснилось, что у обоих доноров подавление пролиферации отмечено только в высоких дозах (рис.4). По-видимому, это может быть связано с разной чувствительностью лимфоцитов на разных этапах дифференцировки к действию проспидина либо зависит от использованного индуктора пролиферации. Полученные ранее результаты [8] свидетельствуют, что эффект проспидина зависит от времени введения по отношению к митогену. Наибольшее угнетение РБТЛ наблюдалось при введении одновременно с ФГА или после него, что позволило авторам предположить о преимущественном действии проспидина на стадии распознавания чужеродного антигена лимфоидными клетками

В таблице 2 суммированы результаты изучения влияния проспидина на ИЛ-2-зависимую пролиферацию лимфоцитов на примере клеточной линии CTLL-2. Результаты свидетельствуют о том, что проспидин обладает способностью подавлять ИЛ-2-зависимую пролиферацию в тех же дозах, в которых ранее отмечалось ингибирующее действие на пролиферацию клеток при активации другими индукторами. Однако в более низких дозах отмечается стимулирующее влияние на пролиферацию клеток CTLL-2, поэтому, можно предположить, что проспидин обладает не просто иммуносупрессивным, но скорее иммуномодулирующим действием.

Данное предположение подтвердилось при оценке влияния проспидина на показатели спонтанной и индуцированной продукции провоспалительных цитокинов, IL-1 альфа, IL-1 бета и IL-8 лейкоцитами периферической крови человека (рис.5-7). В случае индуцированного синтеза обоих форм IL-1 наблюдалось подавление продукции в дозах 1 и 10 мг/мл, что соответствует дозам максимального подавления пролиферации клеток. Однако в максимальной дозе 10 мг/мл проспидин вызывал увеличение спонтанной продукции IL-1 альфа и бета, а также спонтанной продукции IL-8. Более того в дозе 1 мг/мл у одного из двух обследованных доноров отмечено возрастание и индуцированной продигиозаном продукции IL-8 (рис.7). Этими результатами подтверждается иммуномодулирующая активность проспидина, для изучения которой требуются дополнительные исследования.

Таким образом проспидин дозозависимо подавляет пролиферацию различных типов клеток, не вызывая при этом цитотоксического действия, и обладает иммуномодулирующим действием. Полученные данные позволяют определить механизмы влияния проспидина на иммунную систему – вторую не менее важную систему, которая играет важнейшую роль в защите от рака и которая также, как и кроветворная, подавляется цитостатиками. В то же время полученные результаты важны с точки зрения изучения механизмов подавления проспидином иммунологической реактивности, в частности, у больных ревматоидным артритом. Полученные в работе данные о подавлении проспидином индуцированной продукции провоспалительных цитокинов раскрывают один из возможных механизмов его лечебного действия у больных ревматоидным артритом [3], так как блокирование синтеза эндогенных цитокинов является на сегодняшний день наиболее перспективным направлением терапии.

 ЛИТЕРАТУРА

1. Адо В.А., Бородин Ю.П., Горячкина Л.А. и др. Изучение иммунодепрессивных свойств проспидна в эксперименте // Проспидин – новое противоопухолевое средство. Сб.трудов ВНИХФИ, вып.III, М.-1973.-С.56-65.

2. Бененсон Е.В., Немцов Б.Ф. «Антиревматоидное средство проспидин» Патент на изобретение № 1235502. 1986.

3. Бененсон Е.В., Немцов Б.Ф., Краснова С.Л. Новое базисное средство проспидин в терапии ревматоидного артрита. К оценке клинической эффективности и механизма действия проспидина. // Терапевтический архив. –1986.-№12.-С.103-108.

4. Бененсон Е.В., Немцов Б.Ф., Сейсенбаев А.Ш. К оценке влияния проспидина и циклофосфана на показатели Т- и В-иммунного ответа in vitro //Фармакология и токсикология.–1987.-№2.–С.54-56.

5. Бененсон Е.В., Миррахимова Э.М. Клиническая эффективность проспидина при системной красной волчанке // Терапевтический архив. –1989.-№5-С.21-26.

6. Бененсон Б.Ф., Немцов Б.Ф., Тимина О.В. Цитофлюориметрический анализ функциональной активности периферических В-лимфоцитов под влиянием пульс-терапии проспидином и метотрексатом при ревматоидном артрите. Международный конгресс по иммунореабилитации. Тез. докл. - Сочи-Дагомыс, 1994. С.57.

7. Богомолова Н.С., Сускова В.С., Муховатова Л.М. Влияние проспидина и спиробромина на бласттрансформацию лимфоцитов // "Противоопухолевые препараты", Сб. научн. трудов ВНИХФИ, М., 1984, стр. 138-141

8. Демьянов А.В., Котов А.Ю., Симбирцев А.С. Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике // Цитокины и воспаление.-2003.-Т.2.-№3.-С.20-35

9. Евсеенко Л.С., Берсель В.А., Дисветова В.В. и др. О клиническом применении проспидина //Вопросы онкологии. –1970.-Т.17.-№8. – С.36-42

10. Немцов Б.Ф., Тимина О.В. Сравнительная эффективность пульс-терапии проспидином и метотрексатом при ревматоидном артрите (12-мес. контролируемое исследование) //Клиническая медицина.1998 №8, С.25-28.

11. Симонова О.В., Немцов Б.Ф. Комбинированное лечение проспидином и метотрексатом больных псориатическим артритом // Терапевтичесий архив, №7, 2005; с. 60-64.

12. Сухих Е.Н., Немцов Б.Ф., Симонова О.В. Сравнительная оценка эффективности базисной терапии анкилозирующего спондилоартрита. Научные труды V Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке». Москва. 2004. С.269.

13. Тринус Ф.П., Чернов В.А., Рябуха Т.К. и др. Сравнительное изучение противовоспалительного, анальгезирующего и жаропонижающего действия противоопухолевых препаратов //Вопросы онкологии.-1980.-№5.-С.49-54.

14. Чернов В.А., Геодакян С.В. О роли плазматической мембраны в механизме противоопухолевого действия проспидина // Хим. Фарм. журнал.-1976.-№12.-С.7-13.

15. Чупров А.Д., Плотникова Ю.А., Немцов Б.Ф. и др. Подавление ангиогенеза как одно из проявлений иммунодепрессивного действия проспидина //Научно-практическая ревматология. –2001.-№3.-С.133.

Таблица 1. Влияния проспидина на спонтанную пролиферацию клеток различного происхождения (M ± m).

* - различия с контролем достоверны, р < 0,05

Таблица 2. Влияния проспидина на ИЛ-2-зависимую пролиферацию клеток CTLL-2 (M ± m).

* - различия с контролем достоверны, р < 0,05

 Резюме

ВЛИЯНИЕ ПРОСПИДИНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК В КУЛЬТУРЕ

Петров А.В., Пигарева Н.В., Симбирцев А.С.

Цель. Изучить токсичность проспидина в отношении иммунокомпетентных клеток и исследовать его влияние на некоторые показатели функциональной активности различных типов лейкоцитов.

Материал и методы. Биологическую активность проспидина исследовали на первичных культурах клеток лимфоидных органов мышей линии СВА весом 18-20 г из питомника “Рапполово” РАМН, либо на клетках периферической крови здоровых доноров. Уровни цитокинов в супернатантах клеточных культур определяли методом твердофазного ИФА, используя тест-системы ООО «Цитокин».

Результаты. При использовании проспидина в возрастающих концентрациях от 1 нг/мл до 10 мг/мл. токсического действия препарата не наблюдалось, выживаемость тимоцитов составила 96-98%. В первичных культурах лимфоцитов и культурах ряда трансформированных клеточных линий проспидин подавлял  спонтанную и индуцированную пролиферацию всех использованных типов клеток в дозах 1 и 10 мг/мл. Наиболее чувствительными к действию проспидина оказались тимоциты. Проспидин  подавлял ИЛ-2-зависимую пролиферацию в тех же дозах, в которых ранее отмечалось ингибирующее действие на пролиферацию клеток при активации другими индукторами. В более низких дозах отмечалось стимулирующее влияние на пролиферацию клеток CTLL-2.

Заключение. Проспидин дозозависимо подавляет пролиферацию различных типов клеток, не вызывая при этом цитотоксического действия, и обладает иммуномодулирующим действием.

Ключевые слова:  проспидин, цитокины